廣東省醫(yī)療援藏專家李欣攜手上海百趣再添力作！高原研究“五響炮”
西藏林芝市是兼具旅游魅力與科研價值的“西藏江南”，是生物多樣性研究、高原氣候觀測（如林芝高山生態(tài)站）及地質(zhì)演化的關(guān)鍵區(qū)域。其垂直生態(tài)梯度與獨(dú)特地理環(huán)境，為探索自然與科學(xué)提供不可替代的實(shí)地樣本，科學(xué)考察與生態(tài)旅游協(xié)同發(fā)展?jié)摿薮螅强蒲信c旅行者探秘的終極目的地。此前，廣東省醫(yī)療援藏專家、廣東省人民醫(yī)院急診科李欣教授團(tuán)隊(duì)牽頭上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心、中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院及其醫(yī)學(xué)研究中心、林芝市人民醫(yī)院等多家單位揭示了中等海拔暴露會影響人體腸道細(xì)菌和血清代謝組進(jìn)而調(diào)控血糖代謝；后續(xù)又發(fā)現(xiàn)中等海拔暴露下健康人體內(nèi)腸道多界微生態(tài)的變化與血糖和短鏈脂肪酸的代謝變化具有顯著強(qiáng)相關(guān)性。但是中等海拔暴露是否會影響人體腸道微生態(tài)的腸型變化，進(jìn)而導(dǎo)致不同人體對中等海拔暴露后的血清代謝及表型變化上呈現(xiàn)異質(zhì)性，日前在國際上暫無報道。
近日，廣東省醫(yī)療援藏專家、廣東省人民醫(yī)院急診科李欣教授團(tuán)隊(duì)再次牽頭上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心劉志鵬研究員團(tuán)隊(duì)、深圳市人民醫(yī)院劉雪艷教授團(tuán)隊(duì)等多家單位團(tuán)隊(duì)在國際知名學(xué)術(shù)期刊BMC Microbiology（中科院二區(qū)雜志，2024年影響因子/JCR分區(qū)：4.2/Q2）上發(fā)表了題為“Moderate-altitude exposure induced gut microbiota enterotype shifts impacting host serum metabolome and phenome”的論文。研究發(fā)現(xiàn)人體在中等海拔暴露后呈現(xiàn)出2種不同的腸型分布，主要是Blautia腸型與Bacteroides腸型，與血清中的氨基酸、短鏈脂肪酸、中長鏈脂肪酸、膽汁酸及臨床指標(biāo)的變化密切相關(guān)；此外，當(dāng)具有Blautia腸型的基線人群的腸型向Bacteroides腸型轉(zhuǎn)變后，這些人群會獲得更多的健康受益（如血糖、體重指數(shù)(BMI)、低密度脂蛋白(LDL)等顯著性下降），這些結(jié)果提示中等海拔暴露可誘導(dǎo)腸型轉(zhuǎn)變，而以擬桿菌Bacteroides為主的腸型可能是一種與宿主代謝相關(guān)的有益腸型模式。
廣東省醫(yī)療援藏專家、廣東省人民醫(yī)院李欣教授和上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心劉志鵬研究員、深圳市人民醫(yī)院劉雪艷教授為共同通訊作者；廣東省人民醫(yī)院馬永輝博士、王鼎臣碩士和于心怡博士為論文共同第一作者；上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心范艷群和程盼為論文共同作者。
背景介紹
國際共識將2000-3000米定義為中等海拔，3000-5500米為高海拔。高海拔環(huán)境的低壓、低氧等特點(diǎn)可能引發(fā)急性山地病、炎癥增加等健康問題，但有研究報道間歇性低氧暴露或短期高原暴露（3天–7周）能改善小鼠和人類的葡萄糖穩(wěn)態(tài)、心肺功能及體重，因此高海拔對健康的影響尚存爭議。
腸道菌群在維持人體健康中扮演關(guān)鍵角色，其失調(diào)可能誘發(fā)胰島素抵抗和2型糖尿??；而高海拔暴露已被證實(shí)可改變?nèi)撕蛣游锏哪c道菌群組成與功能，進(jìn)而影響宿主表型。腸型分析作為基于腸道菌群群落特征的聚類分型方法，不受年齡、地域等因素限制，為解析腸道微生物定植與功能提供了新視角，但其在中等海拔暴露下的變化及作用，目前國際上尚無研究報道。
本研究募集了127名健康個體，其中一組為來自廣州（平均海拔<50米）的49名健康漢族援藏志愿者，他們于2018年5月進(jìn)入林芝市巴宜區(qū)（平均海拔=2900米），并隨訪跟蹤他們進(jìn)藏后12個月內(nèi)的數(shù)據(jù)；另一組為來自廣州的47名健康漢族志愿者，他們于2018年7月進(jìn)入林芝市，同樣隨訪跟蹤了12個月；最后還有一組數(shù)據(jù)來自在林芝市居住五年以上的31名健康志愿者。本研究使用糞便宏基因組測序技術(shù)評估了中等海拔暴露前后人體的腸道菌群腸型分布情況，并探究了不同腸型對臨床指標(biāo)及血清代謝物（如氨基酸、短鏈脂肪酸、中長鏈脂肪酸和膽汁酸）的影響；還探究了健康個體暴露于中等海拔環(huán)境后，腸型轉(zhuǎn)變對關(guān)鍵腸道菌群物種及與糖代謝調(diào)控相關(guān)代謝物的影響。此外，本研究對高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠(High-Fat Diet, HFD)進(jìn)行了糞菌移植(Fecal Microbiota Transplantation, FMT)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了腸道菌群變化影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)與血清氨基酸代謝的因果關(guān)系。最后，我們還探究了無論腸型是否轉(zhuǎn)變，人體在中等海拔暴露下出現(xiàn)的臨床指標(biāo)和血清代謝物的變化。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
1、糞便宏基因組分析揭示中等海拔暴露人群存在兩種腸型
首先，使用膳食頻率問卷(Food Frequency Questionnaires, FFQ)對縱向研究隊(duì)列中健康個體的飲食習(xí)慣進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這些志愿者在中等海拔暴露前后的膳食營養(yǎng)素攝入量（總能量攝入（千卡/天），P=0.944；碳水化合物攝入（克/天），P=0.548；蛋白質(zhì)攝入（克/天），P=0.645；脂肪攝入（克/天），P=0.065）保持穩(wěn)定。然而，考慮到本研究樣本數(shù)量有限，且FFQ問卷存在受回憶偏差和測量誤差影響的缺陷，飲食變化對腸道菌群的影響值得在未來進(jìn)行更深入的探索研究。
為確定最優(yōu)的腸型分類方法，對從所有募集人群（包括中等海拔暴露前基線、中等海拔暴露6個月和12個月及5年以上的當(dāng)?shù)鼐用瘢┲蝎@得的糞便宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖1A），分別對存在于10%、20%、30%和50%以上樣本中的物種或所有物種的相對豐度進(jìn)行兩種不同腸型模型算法分析：PAM(partitioning around medoids)和DMM(Dirichlet multinomial mixture)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAM在中等海拔暴露前后的個體中均識別出兩種穩(wěn)定的腸型：BL腸型（主要由Blautia組成）和BA腸型（主要由Bacteroides組成）（圖1B），而DMM識別出的腸型則隨所納入物種的不同而出現(xiàn)動態(tài)波動。此外，已有研究表明DMM算法更適合于計數(shù)的16S擴(kuò)增子宏基因組數(shù)據(jù)，PAM聚類方法更適合基于相對豐度的shotgun宏基因組數(shù)據(jù)，這與我們的研究結(jié)果一致。非度量多尺度分析NMDS(Non-metric multidimensional scaling)結(jié)果顯示，BL腸型與BA腸型的微生物組成具有顯著差異(PERMANOVA P<0.001)(圖1C)。在含高豐度擬桿菌(Bacteroides)的BA腸型中，中等海拔暴露個體的占比更高；而在以布勞特氏菌(Blautia)為代表的BL腸型中，基線樣本個體的占比更高；Fisher檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)均顯示，這兩個聚類中人群的分布比例存在顯著差異（圖1D)。此外，基于同一樣本應(yīng)被歸類到同一聚類中3次以上的標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納入存在于30%以上樣本中的物種進(jìn)行PAM分析時，每個腸型中同一樣本的歸類一致性比例高于其他條件（圖1F-G）。因此，本研究后續(xù)腸型分析主要是基于PAM模型且納入存在于30%以上樣本中的物種。有趣的是，盡管DMM模型識別出的腸型會因所分析物種的比例不同而波動，但在中等海拔暴露后人群中同樣識別出了含高豐度擬桿菌的腸型，表明擬桿菌驅(qū)動的腸型可能在個體適應(yīng)中等海拔暴露的過程中發(fā)揮重要作用。綜上所述，個體在中等海拔暴露前后的腸道菌群發(fā)生了顯著變化，且可被分為兩種相對穩(wěn)定的腸型。
圖1. 腸型分析結(jié)果
2、不同腸型對臨床指標(biāo)和血清代謝物的影響
為探究腸型對臨床指標(biāo)和血清代謝物的影響，首先對兩種腸型的29個臨床指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與BL腸型相比，BA腸型的血氧飽和度(SaO?)和腫瘤壞死因子(TNF-α)顯著降低（|Cohen’s d效應(yīng)值|分別為0.09和0.31）。在糖代謝指標(biāo)中，空腹血糖(Fasting Blood Glucose, FBG)、胰島素、C肽和糖化血紅蛋白(HbA1c)均無顯著差異；此外，腎功能相關(guān)指標(biāo)在兩種腸型間也無顯著差異。這表明BL腸型個體的炎癥水平可能較高。
最近有研究報道，血清代謝組的改變可反映健康人群、2型糖尿病患者和漢族肥胖人群腸道菌群的差異。我們對中等海拔暴露前、暴露后6個月、暴露后12個月的個體以及5年以上的當(dāng)?shù)厝巳旱难鍢颖具M(jìn)行了血清靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測，檢測指標(biāo)包括24個氨基酸(Amino Acids，AAs)、7個短鏈脂肪酸(Short-Chain Fatty Acids, SCFAs)、4個中長鏈脂肪酸(Medium-Chain Fatty Acids, MCFAs)和24個膽汁酸(Bile Acids, BAs)。結(jié)果表明（圖2），與BL腸型相比，BA腸型中4個AAs（L-瓜氨酸、L-天冬酰胺、4-羥基脯氨酸和L-蘇氨酸，|Cohen’s d效應(yīng)值|分別為0.97, 0.60, 1.21,1.13）顯著降低，3個AAs（β-丙氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酰胺，|Cohen’s d效應(yīng)值|分別為0.48, 0.77, 0.49）顯著升高；4個 SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸和己酸，|Cohen’s d效應(yīng)值|分別為0.69, 0.63, 0.21,0.39）和1個MCFAs（壬酸，|Cohen’s d效應(yīng)值|為1.10）明顯降低；14個BAs（膽酸、?；悄懰?、甘膽酸等，|Cohen’s d效應(yīng)值|分別為0.82, 0.66, 0.63等）顯著降低，且與胰島素抵抗相關(guān)的炎癥因子TNF-α在BA腸型中的水平顯著低于BL腸型。這些結(jié)果表明，不同的腸道微生物腸型對血清代謝物含量和炎癥水平有重要影響。
圖2. 兩種腸型血清代謝物、臨床指標(biāo)、關(guān)鍵菌和KO的差異分析
3、不同腸型及腸型轉(zhuǎn)變對腸道菌群、血清氨基酸和FBG的影響
在我們之前的研究中，發(fā)現(xiàn)個體在中等海拔暴露后腸道菌群組成發(fā)生了明顯變化，表現(xiàn)為擬桿菌門物種（如卵形擬桿菌B. ovatus、多形擬桿菌B. thetaiotaomicron、單形擬桿菌B. uniformis）富集，這些物種攜帶參與L-谷氨酰胺合成的KO1951（谷氨酰胺合成酶 [EC:6.3.1.2]）；而變形菌門物種（如大腸桿菌E. coli）減少，該物種攜帶參與L-纈氨酸合成的KO0835（纈氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶[EC:2.6.1.66]）和K14260（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 [EC:2.6.1.2]），這與L-谷氨酰胺增加、L-纈氨酸和L-谷氨酸減少以及FBG降低相關(guān)。
基于上述腸型分類，我們發(fā)現(xiàn)與BL腸型相比，BA腸型中B. ovatus、B. thetaiotaomicron和B. uniformis的相對豐度顯著升高，其|Cohen’s d效應(yīng)值|分別為0.77、0.76和1.21；而E. coli的相對豐度降低，|Cohen’s d效應(yīng)值|為0.29（圖2）。我們還進(jìn)一步分析上述腸道微生物功能及相應(yīng)的腸道微生物KO，與變形菌門物種（如E. coli）減少相關(guān)的、參與L-纈氨酸合成相關(guān)的基因K14260在BA腸型中顯著下調(diào)（|Cohen’s d效應(yīng)值|=1.19）（圖2）。這些結(jié)果表明，腸道菌群腸型轉(zhuǎn)變可能影響人體的血糖代謝；然而，我們的研究中未觀察到BL腸型與BA腸型組的FBG水平有顯著性差異。因此，我們推測個體在中等海拔暴露后腸型轉(zhuǎn)變可能會影響宿主表型。
我們進(jìn)一步分析了26名個體在中等海拔暴露前后的腸型變化。結(jié)果顯示，84%的人群在中等海拔暴露前為BL腸型，其中40%人群在暴露后仍為BL腸型，44%轉(zhuǎn)為BA腸型（圖3A）。在BL腸型轉(zhuǎn)為BA腸型的健康個體中，擬桿菌門物種（如B. thetaiotaomicron、B. uniformis）顯著增加，而變形菌門物種（如E. coli）減少（圖3B），K14260顯著降低（圖3C），L-谷氨酸顯著降低（圖3D），且FBG水平顯著改善（圖3E）。這些結(jié)果表明，當(dāng)腸型發(fā)生改變時，特別是從BL腸型到BA的腸型轉(zhuǎn)變，與FBG改善相關(guān)的腸道菌群、微生物功能及血清代謝物都發(fā)生了顯著變化（圖3F）。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)了1名基線為BA腸型的個體轉(zhuǎn)變?yōu)锽L腸型（圖3A），盡管由于樣本量較小，不適合通過Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計分析，但熱圖顯示該個體在中等海拔暴露后從BA腸型轉(zhuǎn)變?yōu)锽L腸型，可能對FBG、腸道菌群和血清代謝物產(chǎn)生不利影響（圖3F）。這在一定程度上可能能夠解釋為什么有人在高海拔暴露后出現(xiàn)血糖異常，表明腸型與血糖的關(guān)系在未來值得進(jìn)一步的研究。此外，我們分別對這兩種腸型的血清代謝物、臨床指標(biāo)與上述腸道菌群進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL腸型中的顯著性相關(guān)關(guān)系數(shù)量多于BA腸型（圖3G-H），如BA腸型中出現(xiàn)了膽汁酸與臨床指標(biāo)之間的正相關(guān)性，但氨基酸間的強(qiáng)正相關(guān)性出現(xiàn)減弱，氨基酸與其他指標(biāo)間的正相關(guān)性也消失了，臨床指標(biāo)與其他指標(biāo)間的負(fù)相關(guān)性出現(xiàn)減弱。這些結(jié)果表明，與BL腸型相比，BA腸型在腸道菌群組成及功能、腸道菌群與人體的血清代謝組和臨床表型間的相互作用等方面上存在顯著差異。
圖3. 中等海拔暴露前后腸型轉(zhuǎn)變對腸道菌群、血清代謝物和FBG的影響
此外，我們將中等海拔暴露12個月后的健康人體的糞便樣本移植至高脂飲食小鼠體內(nèi)，持續(xù)8周（圖4A）。通過分析糞菌移植8周后小鼠糞便樣本的16S rDNA測序數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體小鼠的腸道菌群組成在FMT后發(fā)生顯著變化（圖4B）。與移植前相比，移植后Bacteroides水平顯著升高（圖4C），并伴隨葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的改善（如FBG、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR降低）以及氨基酸代謝調(diào)整（如L-谷氨酰胺和L-組氨酸升高，L-谷氨酸和L-天冬氨酸下降）（圖4D-E）。這些結(jié)果與人類在中等海拔暴露后觀察到的結(jié)果一致，進(jìn)一步表明擬桿菌增加相關(guān)的腸型轉(zhuǎn)變可能對中等海拔暴露后人類代謝產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
圖4. FMT實(shí)驗(yàn)的HFD小鼠的腸道菌群組成、血清氨基酸代謝及表型的變化
4、腸型轉(zhuǎn)變對中等海拔暴露前后人體各項(xiàng)臨床指標(biāo)及血清代謝物的影響
最后，我們探究了腸道菌群腸型轉(zhuǎn)變對中等海拔暴露前后人體的臨床指標(biāo)和血清代謝物（即AAs、SCFAs、MCFAs和BAs）的影響。無論基線腸型是何種類型和暴露后腸型如何轉(zhuǎn)變，人體的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)顯著升高，血清肌酐(Scr)、動脈血氧飽和度(SaO?)、4-羥脯氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-瓜氨酸、L-賴氨酸和異戊酸均顯著下調(diào)（圖5）。無論腸型是否轉(zhuǎn)變，基線為BL腸型的人群在中等海拔暴露后，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、心率(HR)和L-脯氨酸顯著升高，而TNF-α、膽固醇(CHOL)、L-鳥氨酸、L-天冬氨酸、L-組氨酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、庚酸、癸酸、壬酸和?；蛆Z脫氧膽酸顯著降低。與基線BL組相比，BL→BA轉(zhuǎn)變組的HbA1c、異丁酸和甘氨豬脫氧膽酸顯著升高，而FBG、體重(BW)、BMI、LDL、瘦素、3-甲基-L-組氨酸、辛酸、鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、?；敲撗跄懰岷透拾毙苊撗跄懰犸@著降低。
圖5. 中等海拔暴露前后腸型轉(zhuǎn)變對人體臨床指標(biāo)和血清代謝物的影響
研究結(jié)論
本研究首先基于糞便鳥槍法宏基因組學(xué)技術(shù)，識別出以Blautia為主的BL腸型和以Bacteroides為主的BA腸型，且兩種腸型間氨基酸、短鏈脂肪酸、中長鏈脂肪酸、膽汁酸和臨床指標(biāo)均出現(xiàn)了顯著性差異；此外還發(fā)現(xiàn)中等海拔暴露可誘導(dǎo)腸型轉(zhuǎn)變并通過FMT實(shí)驗(yàn)對人體研究的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究增強(qiáng)了我們對中等海拔暴露、腸道微生物群腸型、宿主代謝組和FBG之間相互作用的理解，且提示我們中等海拔暴露可能成為未來控制FBG和脂肪酸水平的潛在策略，可以為改善常見的代謝綜合征(如糖尿病和心血管疾病等)開辟新的途徑。
