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01 焦磷酸測(cè)序原理

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一種準(zhǔn)確、定量、簡(jiǎn)便、快速的核酸序列測(cè)定技術(shù)。焦磷酸測(cè)序反應(yīng)體系包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等， 以及5′-磷酰硫酸(APS)、熒光素、待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物等。引物與模板單鏈DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶協(xié)同作用下，將特定的dNTP與單鏈互補(bǔ)聚合，并釋放一次熒光信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)、定量測(cè)定DNA序列目的。

圖一：焦磷酸反應(yīng)原理

02 焦磷酸測(cè)序主要應(yīng)用

1. SNP、插入、缺失、CNV等單鏈多態(tài)性研究；

2. DNA甲基化定量測(cè)定；

3. 病原微生物快速鑒定；

4. 其他核酸序列測(cè)定等。

03 產(chǎn)品規(guī)格及包裝

規(guī)格：23測(cè)試/盒，46測(cè)試/盒，100測(cè)試/盒，200測(cè)試/盒，1000測(cè)試/盒。

圖2  焦磷酸測(cè)序試劑盒

04 產(chǎn)品主要成分

DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶、APS、熒光素、堿基、水等。

05 配套技術(shù)平臺(tái)

試劑應(yīng)用于武漢菲思特生物科技有限公司PYROSEQ-E16焦磷酸測(cè)序儀、凱杰PyroMark Q96 、Q48焦磷酸測(cè)序儀等焦磷酸測(cè)序儀。

06 樣本要求

全血、咽拭子、FFPE樣本、體液、各種細(xì)胞組織、游離DNA等。

07 簡(jiǎn)要操作步驟（以菲思特焦磷酸測(cè)序儀為例）

1. PCR擴(kuò)增、單鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至測(cè)序管；測(cè)序管加入 3uL 測(cè)序酶和 3uL 測(cè)序底物。

2. 取dNTP 排管，依次加入 20μldATPαS、20μl dTTP、20μl dGTP、20μl dCTP。堿基平鋪在排管底部。

3. 將清洗水槽、dNTP 排管、測(cè)序管放入測(cè)序儀指定位置。

4. 啟動(dòng)測(cè)序。

5. 測(cè)序結(jié)束單擊“保存”按鈕。單擊“輸出報(bào)告”輸出基因型結(jié)果。

圖3 相關(guān)試劑、設(shè)備例圖

圖4 檢測(cè)結(jié)果解讀示例

08 產(chǎn)品性能指標(biāo)

準(zhǔn)確性：99.95%以上；

重復(fù)性：CV≤2%；

測(cè)序長(zhǎng)度：50bp以上；

最低檢出限：0.1%。

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